Tänapäeva geeniinseneride käsutuses on suur hulk ressursse: Internetis saadaolevate tohutute andmekogumite arv, ülitäpsed geenide redigeerimise tööriistad, nagu CRISPR, ja odavad geenide sekveneerimismeetodid. Kuid uute tehnoloogiate levikuga pole kaasnenud selget tegevuskava, mis aitaks teadlastel välja selgitada, milliseid geene sihtida, milliseid vahendeid kasutada ja kuidas nende tulemusi tõlgendada. Niisiis otsustas Harvardi Wyssi bioloogiliselt inspireeritud tehnikainstituudi Harvardi meditsiinikooli (HMS) teadlaste ja inseneride meeskond ja MIT Media Lab selle luua.
Wyssi meeskond on loonud geneetilise sõeluuringu läbiviimiseks integreeritud torustiku, mis hõlmab protsessi kõiki etappe alates huvipakkuvate sihtgeenide tuvastamisest kuni kloonimiseni ning nende kiire ja tõhusa sõelumiseni. Protokolli, mida nimetatakse järjestuspõhiseks sihtmärgi tuvastamiseks ja modulaarseks häiringusõelumiseks (STAMPScreen), kirjeldatakse jaotises Cell Reports Methods ja seotud avatud lähtekoodiga algoritmid on saadaval GitHubis.
"STAMPScreen on täiustatud töövoog, mis muudab teadlaste jaoks huvipakkuvate geenide tuvastamise ja geneetiliste sõeluuringute tegemise lihtsaks, ilma et nad peaksid arvama, millist tööriista kasutada või milliseid katseid soovitud tulemuste saamiseks teha," ütles vastav autor. Pranam Chatterjee, Ph. D., endine MIT Media Labi magistrant, kes on nüüd Carlos M. Varsavsky teadur HMS-is ja Wyssi Instituudis. "See ühildub täielikult paljude olemasolevate andmebaaside ja süsteemidega ning loodame, et paljud teadlased saavad STAMPScreeni ära kasutada, et säästa aega ja parandada oma tulemuste kvaliteeti."
Frustratsioon on leiutamise ema
Chatterjee ja paberi kaasautor Christian Kramme olid pettunud. Kaks teadlast püüdsid uurida bioloogia erinevate aspektide – nagu viljakus, vananemine ja immuunsus – geneetilisi aluseid, kombineerides digitaalsete meetodite (mõelge algoritme) ja geenitehnoloogia (mõelge geenide järjestamisele) tugevaid külgi. Kuid neil tekkis pidev alt probleeme erinevate kasutatavate tööriistade ja protokollidega, mis on teaduslaborites tavalised.
Algoritmid, mille eesmärk oli sõeluda läbi organismi geene, et tuvastada geenid, millel on oluline mõju antud bioloogilisele protsessile, võisid kindlaks teha, millal geeni ekspressioonimuster muutus, kuid ei andnud mingit ülevaadet selle muutuse põhjustest. Kui nad tahtsid elusrakkudes testida kandidaatgeenide loendit, ei olnud kohe selge, millist tüüpi katset nad peaksid läbi viima. Ja paljud saadaolevad tööriistad geenide rakkudesse sisestamiseks ja nende skriinimiseks olid kallid, aeganõudvad ja jäigad.
"Kasutasin Golden Gate'i ja Gateway nime all tuntud meetodeid, et kloonida geene vektoritesse skriinimiskatsete jaoks ning mul kulus 50 geeni kloonimiseks kuid ja tuhandeid dollareid. Gateway abil ei saanud ma geenid, et tuvastada, milline neist millisesse vektorisse sattus, mis oli minu allavoolu järjestuspõhise katsekujunduse jaoks ülioluline nõue. Arvasime, et seda tüüpi uuringute tegemiseks peab olema parem viis, ja kui me seda ei leidnud, siis me võttis vastu väljakutse luua see ise, " ütles Kramme, kes on Wyssi Instituudi ja HMSi magistrant
Kramme tegi koostööd kaas-esimese autori ja Kiriku labori liikme Alexandru Plesaga, kes koges oma projekti jaoks geenivektorite loomisel identseid pettumusi. Seejärel asusid Kramme, Plesa ja Chatterjee välja töötama, mida on vaja geneetilise sõeluuringu täielikuks platvormi loomiseks, mis toimiks kõigi nende projektide jaoks, mis ulatusid valgutehnoloogiast kuni viljakuse ja vananemiseni.
Bittidelt pingile
Geeniuuringute varaseima etapi täiustamiseks – uurimiseks huvipakkuvate geenide tuvastamiseks – lõi meeskond kaks uut algoritmi, mis aitavad rahuldada arvutustööriistade vajadust, mis suudavad analüüsida ja hankida teavet üha suurematest andmekogumitest, mida genereeritakse. järgmise põlvkonna järjestuse (NGS) kaudu. Esimene algoritm võtab standardsed andmed geeni ekspressioonitaseme kohta ja ühendab need teabega raku oleku kohta, samuti teabega selle kohta, millised valgud teadaolev alt geeniga interakteeruvad. Algoritm annab kõrge hinde geenidele, mis on tugev alt seotud teiste geenidega ja mille aktiivsus on korrelatsioonis suurte rakutasandi muutustega. Teine algoritm annab kõrgetasemelisema ülevaate, luues võrgud, mis kajastavad geeniekspressiooni dünaamilisi muutusi rakutüübi diferentseerumise ajal, ja seejärel rakendades protsessi peamiste regulaatorite järjestamiseks kesksuse meetmeid, nagu Google'i PageRank algoritm.
"Geeniuuringute arvutuslik osa on nagu Jenga mäng: kui iga plokk tornis esindab geeni, siis otsime geene, mis moodustavad Jenga torni aluse, geene, mis hoiavad enamik algoritme suudab teile öelda ainult, millised geenid on üksteisega samas reas, kuid meie algoritmid võimaldavad teil kindlaks teha, kui kaugel tornist üles või alla need on, et saaksite kiiresti tuvastada need, millel on kõige suurem. mõju kõnealusele raku olekule," ütles Chatterjee.
Kui sihtgeenid on tuvastatud, liigub STAMPScreeni protokoll sülearvutist laborisse, kus tehakse katseid nende geenide katkestamiseks rakkudes ja vaadatakse, millist mõju see häirimine rakule avaldab. Teadlaste meeskond hindas süstemaatiliselt mitmeid geenide häirimise tööriistu, sealhulgas komplementaarset DNA-d (cDNA) ja mitmeid CRISPR-i versioone inimese indutseeritud pluripotentsetes tüvirakkudes (hiPSC-des), mis on esimesed teadaolevad pea-peade võrdlused, mis viidi läbi täielikult selles väga mitmekülgses, kuid väljakutseid pakkuvas rakutüübis..
Nad lõid seejärel uue tööriista, mis võimaldab kasutada CRISPR-i ja cDNA-d samas lahtris, et avada sünergia kahe meetodi vahel. Näiteks saab CRISPR-i kasutada geeni kõigi isovormide ekspressiooni väljalülitamiseks ja cDNA-d saab kasutada iga isovormi järjestikuseks ekspresseerimiseks eraldi, mis võimaldab nüansirikkamaid geneetilisi uuringuid ja vähendab oluliselt sihtmärk-väliste geenide taustekspressiooni.
Teeki vöötkoodide skannimine
Paljude geenikatsete järgmine samm on skriinimisraamatukogu loomine geenide rakkudesse viimiseks ja nende mõjude jälgimiseks. Tavaliselt sisestatakse geenifragmendid bakteriplasmiididesse (ringikujulised DNA tükid), kasutades meetodeid, mis sobivad hästi väikeste DNA tükkide puhul, kuid on tülikas kasutada suuremate geenide sisestamisel. Paljud olemasolevad meetodid tuginevad ka Gateway-nimelisele tehnikale, mis kasutab lambda-faagi rekombinatsiooni ja toksiini tootmist, et tappa kõik bakterid, mis ei saanud huvipakkuva geeniga plasmiidi. Nendes plasmiidides sisalduva toksiiniga on laboris töötamine sageli tülikas ja see võib tahtmatult inaktiveerida, kui vektorile lisatakse "vöötkoodi" järjestus, mis aitab teadlastel tuvastada, millise geeni kandva plasmiidi vektor sai.
Kramme ja Plesa töötasid Gatewayga, kui mõistsid, et neid probleeme saab lahendada, kui nad kõrvaldaksid toksiini ja asendaksid selle plasmiidis lühikeste järjestustega, mille tunneb ära ja lõikab ära teatud tüüpi ensüüm, mida nimetatakse meganukleaasideks. Meganukleaasi äratundmisjärjestused ei esine ühegi teadaoleva organismi geenides, tagades sellega, et ensüüm ei lõika kloonimise käigus kogemata sisestatud geeni ise. Need äratundmisjärjestused kaovad loomulikult, kui plasmiid saab huvipakkuva geeni, muutes need plasmiidid meganukleaasi suhtes immuunseks. Kõik plasmiidid, mis huvipakkuvat geeni eduk alt vastu ei võta, säilitavad aga need äratundmisjärjestused ja meganukleaasi lisamisel lõigatakse tükkideks, jättes alles ainult sisestatud geeni sisaldava puhta plasmiidide kogumi. Uue meetodi, mille teadlased nimetasid MegaGate'iks, kloonimise edukuse määr oli 99,8% ja see võimaldas neil vektoreid hõlps alt vöötkoodida.
"MegaGate mitte ainult ei lahenda paljusid probleeme, millega me vanemate kloonimismeetoditega kokku puutusime, vaid see ühildub ka paljude olemasolevate geeniraamatukogudega, nagu TFome ja hORFeome. Saate sisuliselt Gateway ja meganukleaasid riiulilt eemaldada, pange need kokku geenide raamatukogu ja vöötkoodiga sihtvektorite raamatukoguga ning kaks tundi hiljem on teil huvipakkuvad vöötkoodiga geenid. Oleme sellega klooninud peaaegu 1500 geeni ja pole veel ebaõnnestunud," ütles ta. Plesa, kes on Wyssi Instituudi ja HMSi magistrant.
Lõpuks näitasid teadlased, et nende vöötkoodiga vektoreid saab eduk alt sisestada elavatesse hiPSC-desse ja rakkude kogumeid saab analüüsida NGS-i abil, et teha kindlaks, milliseid tarnitud geene kogum ekspresseerib. Samuti kasutasid nad eduk alt erinevaid meetodeid, sealhulgas RNA-Seq, TAR-Seq ja Barcode-Seq, et lugeda nii geneetilisi vöötkoode kui ka kogu hiPSC-de transkriptoome, võimaldades teadlastel kasutada mis tahes tööriista, mida nad kõige paremini tunnevad.
Tiim eeldab, et STAMPScreen võib osutuda kasulikuks paljudes erinevates uuringutes, sealhulgas radade ja geenide reguleerimise võrgustiku uuringutes, diferentseerimisfaktori sõeluuringus, ravimite ja komplekssete radade iseloomustustes ning mutatsioonide modelleerimises. STAMPScreen on samuti modulaarne, võimaldades teadlastel selle erinevaid osi oma töövoogudesse integreerida.
"Avalikult kättesaadavates geneetilistes andmekogumites on aardelaudu teavet, kuid sellest teabest saab aru ainult siis, kui kasutame selle analüüsimiseks õigeid tööriistu ja meetodeid. STAMPScreen aitab teadlastel jõuda eureka hetkedeni kiiremini ja kiirendab geenitehnoloogia innovatsiooni tempo,“ütles vanemautor George Church, Ph. D., Wyssi põhiteaduskonna liige, kes on ka HMSi geneetikaprofessor ning Harvardi ja MIT-i terviseteaduste ja -tehnoloogia professor.
"Wyssi Instituudis püüame leida mõjusaid "moonshot" lahendusi pakiliste probleemide lahendamiseks, kuid me teame, et Kuule jõudmiseks peame esm alt ehitama raketi. See projekt on suurepärane näide sellest, kuidas meie kogukond teeb lennult uuendusi, et võimaldada teaduslikke läbimurdeid, mis muudavad maailma paremaks,“ütles Wyssi asutajadirektor Don Ingber, MD, Ph. D., kes on ka Judah Folkman. HMS-i vaskulaarbioloogia ja Bostoni lastehaigla vaskulaarbioloogia programmi professor, samuti Harvardi John A. Paulsoni tehnika- ja rakendusteaduste kooli bioinseneriteaduse professor.
Aruande lisaautorite hulka kuuluvad Helen Wang, Bennett Wolf, Merrick Smela, Ph. D. Xiaoge Guo ja Ph. D. Richie Kohman. Wyssi Instituudist ja HMS-ist.
